This special issue launched by CNHUPO (HUPO in China) reviews the major advances in proteomics from 2001 (HUPO initiation) to 2021 (the 20th anniversary of HUPO). Jiaqi Zhang wrote the draft. Prof. Shengce Tao, Prof. Xiaobo Yu, Sir Shanjun Chen and I reviewed the scientific content. Permission to reproduce and modify the issue was granted. The original version (Chinese) could be referenced here. You could use the Language Switch icon at the top right of this page for assisted reading.
The original title: Michael Snyder | 蛋白质芯片技术先驱
理解复杂的细胞系统需要识别和分析其中的每个组成部分，并确定它们是如何共同发挥作用及其调节机制。其中的一个关键步骤是确定蛋白质的生化活动以及这些活动如何被其他蛋白质所控制、改变。
在高通量方法被广泛应用以前，蛋白质的生化活动是通过研究单种分子来阐释的，即一种分子做一次实验。这种研究方式看似非常有针对性，实则耗时费力，而研究效果也不理想。
21世纪初，随着高通量技术的普及及广泛应用，蛋白质芯片 (Protein Chip/Protein microarray，又称蛋白质微阵列）技术诞生，该技术不仅为研究人员解决了以上困境，更帮助蛋白质组学开疆拓土，走入新的研究深度与产业化维度。
1 蛋白质芯片的起源
生物芯片（Biochip）分析技术是一种高通量、微型化和自动化的分析技术，可以快速产生大量可重复和可靠的数据信息。生物芯片主要包含DNA芯片和蛋白质芯片两大类，其中DNA芯片/基因芯片（DNA chip/ Gene chip，DNA microarray，又称DNA微阵列技术）发端于上世纪90年代初。目前，DNA芯片的价值已被科学家广泛证明、认可，并应用于基因表达模式、定位转录因子的结合位点，以及检测大规模序列突变和缺失的研究中。在不断发展DNA芯片技术的同时，科学家们也发现了该技术的局限性。基因芯片是通过检测mRNA丰度来确定基因的表达模式及表达水平。许多基因的表达受制于转录调控，而蛋白质的表达则因翻译后修饰发生“巨变”。因此，基因的表达与蛋白质的表达并不能画上等号，也不总是呈线性相关。相关文章更指出，基因与其蛋白质的表达存在20倍或以上的差异。换而言之，通过基因芯片技术所测定的mRNA水平不能精确地反应蛋白质表达水平。另一方面，从生物意义（中心法则）和临床意义（疾病诊疗）上来说，基因仅是信息的存档者，蛋白质才是生命活动的最终执行者。因此，蛋白质才是解开生物和医学谜题的最直接指示物。研究人员可以通过对正常及病理状态下的蛋白质分子特性及变化规律进行深入分析，以更好地理解、区分健康和疾病状态下的蛋白质分子作用机制及其发展变化路径，为疾病治疗和诊断、阐明药物敏感性和耐药性的机制提供进一步的见解。研究人员亦为此踏上蛋白质芯片技术的开发之路。2000年，Gavin MacBeath和Stuart Schreiber两位科学家将酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid）与体外生化检测技术（Biochemical assays）进行结合，开发了基于微阵列的蛋白质功能研究方法，并证明该技术可用于确定蛋白质之间的相互作用，识别蛋白质激酶底物，以及小分子靶标发现的三项研究中。Schreiber激动地表示，该项成果掷地有声地宣告着蛋白质芯片技术发展的启动！媒体更对这项工作大加赞扬，称其将引发新一轮的蛋白质研究热潮，即成为探索蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-脂质以及蛋白质-其他小分子相互作用机制的核心利器。他们亦预言蛋白质芯片将在不久的将来被广泛使用，且在全基因组水平分子相互作用研究中占据重要地位！
▲ Gavin MacBeath和Stuart Schreiber发表文章 Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination。
2 攻坚｜蛋白质芯片基质的探索
虽然Gavin MacBeath和Stuart Schreiber的研究结果非常振奋人心，基因芯片也为蛋白质芯片的发展做足了“前情提要”，但蛋白质芯片的开发仍面临着不小的挑战。与基因芯片不同，蛋白质的大小、形状和化学性质上具有广泛的异质性，这意味着基质除了需满足高密度点样外，还需确保固定化后蛋白质结构和生物功能蛋白质不被影响。1999年，Gerald Walter带领团队以聚偏二氟乙烯膜（PVDF）为蛋白质芯片基质，成功完成cDNA文库中蛋白质的表达、克隆工作，并利用抗体将其检测出来，且不正确阅读框架中表达蛋白的假阳性克隆率很低（仅为11%）。
▲Gerald Walter等科学家发表文章 Protein microarrays for gene expression and antibody screening。
2000年，Hugo Hämmerle等科学家以硝酸纤维素（Nitrocellulose）为基质材料，同时分析了18种已知自身抗原。生物领域的知名作家Michael Eisenstein亦大赞称硝化纤维素为蛋白质芯片中的一个永恒经典，是最受欢迎的基质之一。这也与乔治梅森大学（George Mason University）应用蛋白质组学和分子医学中心联合主任Emanuel Petricoin的观点不谋而合。他认为硝酸纤维素的结合能力优于其他基质材料，而且价格便宜，可以大规模生产、应用。
▲Hugo Hämmerle等科学家发表文章 A microarray enzyme-linked immunosorbent assay for autoimmune diagnostics
另一方面，表面经过化学处理的载玻片也是蛋白质芯片常用的基质材料。Genometrix公司通过将载玻片置于氨丙基三甲氧基硅烷（Aminopropyltrimethoxysilane, APTES）溶液中浸润10分钟，使其完成化学功能化。TeleChem公司研发的SuperAldehyde载玻片表面带有一层醛基修饰，可与蛋白质N端的氨基或赖氨酸的氨基发生共价结合形成希夫碱（Schiff base）结构以衬托蛋白。此外，科学家们也可以在干净的载玻片覆上一层牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）分子，并利用化学试剂“激活” 牛血清白蛋白中的赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）和谷氨酸（Glu）残基，以与被测蛋白形成脲的结构或发生氨基偶联反应，从而实现稳定蛋白的作用。
3 里程碑｜蛋白质芯片的开发
2001年，在前人多次尝试探索的基础上，耶鲁大学（Yale University）分子、细胞和发育生物学系教授兼主任Michael Snyder (现任职于斯坦福大学，Stanford University）与约翰·霍普金斯大学（The Johns Hopkins University）的蛋白质微阵列技术先驱朱衡博士等科学家成功开发了被广泛认可的蛋白质芯片（酵母蛋白质芯片，该芯片包含了酿酒酵母基因组所编码的6000多种蛋白中的5800种），并利用它来研究蛋白质－蛋白质、蛋白质－脂质的相互作用机制。（注：上海交通大学陶生策教授2004-2008年在朱衡教授实验室接受博士后训练，在国内建立了完整的蛋白质芯片研究体系，开发了系列蛋白质芯片及相关应用，请于文末“查看原文”查看陶生策教授相关介绍，或点击链接https://taolab.sjtu.edu.cn）。
▲ Michael Snyder （左）和朱衡教授（右）等科学家发表文章 Global Analysis of Protein Activities Using Proteome Chips。
Snyder团队通过克隆开放阅读框（Open reading frames）以及将谷胱甘肽S-转移酶-聚组氨酸标签（Glutathione S-transferase–polyhistidine, GST-HisX6）融合至蛋白N端，成功克隆纯化了5800种不同的酵母蛋白，占整个酵母蛋白质组组成的80%！然后使用机器人技术（Robotic technology）将微量纯化的蛋白高密度地点在带有镍涂层的载玻片（Nickel-coated slides）上，即微阵列芯片（Microarray chip）；再用被荧光标记的蛋白质与芯片上的点样蛋白作用。根据蛋白质分子间的特异性结合原理，检测、量化蛋白质芯片上的荧光强度以确定相互作用的蛋白质，成功发现了一些新的钙调蛋白和磷脂相互作用蛋白。 该研究开创了首个几乎能分析所有酵母蛋白质的功能性蛋白质芯片（Functional protein microarrays；蛋白质芯片主要分为两类：分析性芯片和功能性芯片），而此研究成果发表前，许多科学家认为大规模、几乎完整的蛋白质组研究是一件不可能的事！
4 蓬勃｜蛋白质芯片“效应”
Snyder不仅打破“不可能”，还将这种“可能”化为全球性成果。他将该技术应用于制造人类蛋白质芯片中，希望以此加速人类生物学的理解进程。另一方面，耶鲁大学将这项技术授权给生物技术公司Protometrix, Inc.以实现产业转化，用以研究所有生物体的蛋白质功能，并期待其成为推动全球制药及其他行业发展的重要工具。Snyder认为，这项技术不仅能够帮助研究人员更快地了解许多蛋白质的功能，更能进一步加快疾病诊断方法的发展及促进药物靶标的发现进程。事实也确实如此，在这项技术成果发表以后，相关的基础研究以及临床应用研究不断涌现。研究人员也依靠微阵列技术取得重大成就——揭示了多种生物体（如人类、酵母、大肠杆菌、结核分枝杆菌以及新冠病毒等）的蛋白质组以推动生物学的发展。此外，蛋白质芯片还能够进行许多翻译后修饰的大规模研究，即磷酸化（Phosphorylation）、乙酰化（Acetylation）、泛素化（Ubiquitylation）、S-亚硝基化（S-nitrosylatio），这对于了解蛋白质的合成和功能至关重要。
相对于质谱技术，蛋白质芯片技术不需要对样本进行预处理、检测速度快，在大规模检测体液（如血清、血浆）样本中低丰度蛋白和（自身）抗体具有独特的技术优势。其中值得一提的是，人体血液中存在大量自身抗体，对维持人体自身平衡、区分正常与异常增殖细胞和免疫系统紊乱非常重要，涵盖了肿瘤、心血管疾病、自身免疫病和传染病等1000余种人类相关疾病。蛋白质芯片可有效发现和鉴定血清中可用于人类疾病诊断和治疗的新型自身抗体标志物分子。
在中国，上海交通大学系统生物医学研究院的陶生策教授课题组和国家蛋白质科学中心-北京的于晓波研究员课题组在蛋白质芯片技术和生物学、临床应用方面取得了一定的成绩，开发出了人类、肺结核和新冠肺炎病毒等高密度蛋白质芯片，并发现了多个有望用于肿瘤、自身免疫性疾病和传染病检测和治疗的标志物分子。其中于晓波团队研发的基于氨基酸分辨率的新冠病毒全蛋白质组学多肽芯片（ACS Cent Sci. 2020 6(12):2238-2249）作为经典案例录入美国化学会旗舰期刊ACS Central Science的新冠肺炎技术特刊，被Nature、Nature Immunology、Nat Struct Mol Biol 和Nature Communications等权威期刊大量引用。我们期待蛋白质芯片技术不断取得长足发展，与质谱互补，成为精准医学研究的重要利器！
▲ 于晓波团队研发基于氨基酸分辨率的新冠病毒全蛋白质组学多肽芯片，并发表文章SARS-CoV-2 proteome microarray for mapping COVID-19 antibody interactions at amino acid resolution。
参考资料
1. Lee, Y. S., & Mrksich, M. (2002). Protein chips: from concept to practice. Trends in biotechnology, 20(12), s14-s18.
2. MacBeath, G., & Schreiber, S. L. (2000). Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science, 289(5485), 1760-1763.
3. Sutandy, F. R., Qian, J., Chen, C. S., & Zhu, H. (2013). Overview of protein microarrays. Current protocols in protein science, 72(1), 27-1.
4. Zhu, H., Bilgin, M., Bangham, R., Hall, D., Casamayor, A., Bertone, P., … & Snyder, M. (2001). Global analysis of protein activities using proteome chips. Science, 293(5537), 2101-2105.
5. 邢婉丽, & 程京. (2004). 检测型生物芯片.生物芯片技术(pp.73). 清华大学出版社有限公司.
6. Eisenstein, M. (2006). Growing pains. Nature, 444(7121), 959-959.
7. Yale University. (2001). Yale Researchers Develop First Microarray Chip for Complete Analysis of Proteins. Retrieved from https://medicine.yale.edu/news-article/yale-researchers-develop-first-microarray-chip-for-complete-analysis-of-proteins/
8. Wang, H., Wu, X., Zhang, X., Hou, X., Liang, T., Wang, D., … & Yu, X. (2020). SARS-CoV-2 proteome microarray for mapping COVID-19 antibody interactions at amino acid resolution. ACS Central Science, 6(12), 2238-2249.
