Note: This is a Chinese review for a recent talk of Prof. Nikolai Slavov, focusing on the recent advances of single cell proteomics developed by his lab. Yingqiu and Jiaqi helped with drafting and revising, respectively. The formatted version (Chinese) could be referenced here. You could use the Language Switch icon at the top right of this page for assisted reading.
Original title: YIPA研讨会 | Nikolai Slavov 探讨单细胞蛋白组学前沿技术
Talk Theme: Accessible methods for high-throughput, deep and accurate single-cell proteomics
1. Nikolai Slavov 教授的基本介绍
Nikolai Slavov于2004年在麻省理工学院（MIT）读完本科后，在普林斯顿（Princeton University）大学Botstein实验室攻读博士学位。Nikolai Slavov教授在美国东北大学（Northeastern University）开始职业生涯后，他主要致力于单细胞蛋白质组学的研究。
2.为什么要研究单细胞蛋白质组？
组成生物体的细胞类型多种多样，同种类型的细胞也有可能由于处于不同细胞周期等原因而存在显著差异，这些差异构成了细胞的异质性，并且能够反映在单个细胞的蛋白质组中。单细胞蛋白质组学能够帮助我们发现不同细胞间的蛋白组差异，区分和量化不同的细胞，进一步识别蛋白间的调控机制和相互作用，从而解决多种生物学问题 (Slavov, 2022)。然而，如何高通量地获得单个细胞的蛋白及多肽样本，并高效地进行质谱数据采集、多肽序列识别，是蛋白质组学领域的重大挑战。如图1所示，Nikolai Slavov团队自步入这个领域以来，已经在单细胞蛋白质组学各步骤的方法开发上取得了一些成绩。
图1. Nikolai Slavov 团队近期在单细胞蛋白质组学领域取得的成绩
3. 自动化单细胞样本制备（Automated single-cell sample preparation）
样本制备是单细胞蛋白质组学需要面临的第一个挑战。在利用质谱进行数据采集前，我们需要通过样本制备获得单个细胞的多肽样本，并且尽可能地减少样本损失和污染。Nikolai Slavov团队目前已开发了多种单细胞样本自动制备装置（https://sample-prep.slavovlab.net/）。其中最简单的一种是基于96或384孔板的mPOP技术（Minimal ProteOmic sample Preparation）。首先用流式细胞仪将单个细胞分选至孔板，每个孔接收一个细胞，采用优化的自热循环系统进行细胞裂解和蛋白提取，然后利用自动液体处理系统进行蛋白酶解。这种方法的优势是材料和设备易获得，局限性是反应体系的体积相对较大、效率偏低。在此基础上，Nikolai Slavov团队近期开发了新一代单细胞样本制备技术nPOP（nano-ProteOmic sample Preparation），旨在增加样本制备的通量和减少单个样本的体积，达到了纳升级别。如图3所示，这种技术是在载玻片上实现的。首先，单个细胞被加载到载玻片上的DMSO（Dimethyl Sulfoxide）微液滴中以裂解细胞，然后向微液滴中加入胰蛋白酶进行蛋白消化，放置一段时间使液滴蒸发，再对单细胞样本进行TMT（Tandem mass tag）标记。最后，多肽样本被转移至孔板中并进行质谱数据采集。除了样本转移，整个过程是完全自动化的，可以高通量地同时制备大约2000个单细胞样本，且实验的耗材廉价易得。通过Thermo Q-Exactive质谱仪搭配纳升流速的液相系统对制备得到的单细胞样本进行数据采集，在60分钟的液相梯度下，每个细胞可以鉴定到约1000个蛋白。
图2. Nikolai Slavov 团队开发的自动化单细胞样本制备技术
图3. 微液滴样本制备技术流程图
4. 基于质谱技术的单细胞蛋白质组学方法SCoPE-MS（Single Cell ProtEomics by Mass Spectrometry，SCoPE-MS）
2018年，Nikolai Slavov团队开发了SCoPE-MS的技术 (Budnik, Levy, Harmange, & Slavov, 2018)，在单细胞蛋白质组分析中引入多重通路技术（multiplex）和经同位素标记的载体样本（carriers），以增加单细胞样本分析通量和增强样本的质谱响应信号。SCoPE-MS的原理如图4所示：每张一级谱图中，前体离子的信号是来自所有标记样本中的同一肽段信号的总和，从而增强信号响应、触发二级质谱；对应二级谱图中的报告基团信号则可以区分不同的标记样本，帮助研究者对肽段的来源进行确定，并进一步获得单细胞样本中的蛋白质相对定量水平。为了提高方法的可靠性，Nikolai Slavov团队还就载体样本的使用数量等细节进行了优化 (Specht & Slavov, 2021)。
图4. SCoPE-MS技术概念图
5. 基于优先数据采集的SCoPE方法pSCoPE （prioritized Single Cell ProtEomics, pSCoPE）
在基于质谱的单细胞蛋白质组学方法中，只能对一部分前体离子进行MS2扫描，且通常只有不到一半肽段能被鉴定到。为了解决这一问题，Nikolai Slavov团队在SCoPE的基础上开发了一种优先单细胞蛋白质组数据采集方式pSCoPE，取代传统数据依赖性采集(Data dependent Acquisition, DDA) 仅挑选丰度最高的前体离子进行MS2分析的策略，而是从并行的单细胞多肽样本中挑选预设的优先肽进行MS2分析，从而将有限的MS2扫描时间分配给可能性最高的离子，以提高扫描效率和数据的一致性。结果如图8所示，相比传统方法，pSCoPE使单细胞样本中多肽和蛋白的鉴定量提高了近一倍，在减少数据损失的同时，提高了单细胞蛋白质组数据的覆盖深度和准确性。Nikolai Slavov教授介绍了几项pSCoPE的应用研究。如图6所示，pSCoPE用于比较经脂多糖和未经脂多糖处理的单巨噬细胞蛋白质组(Huffman et al., 2022)，根据分析得到的差异蛋白能够区分出两种状态不同的巨噬细胞；此外，该研究还分析了单个巨噬细胞中蛋白质水解是如何变化的，即蛋白的转录后修饰。单细胞蛋白组的定量结果与大量细胞蛋白质组的结果一致，说明通过pSCoPE获得的蛋白质组数据是有生物学前景的。
图5. pSCoPE能够显著提高多肽和蛋白的鉴定量
图6. pSCoPE在研究巨噬细胞蛋白质组中的应用
Nikolai Slavov 团队在一项分析细胞分裂周期（Cell division cycle）蛋白变化的工作中应用了nPOP和pSCoPE技术 (Leduc, Huffman, Cantlon, Khan, & Slavov, 2022)。他们首先根据DNA对处于不同细胞周期的单核细胞和黑色素瘤细胞进行分组，然后采用nPOP技术分别提取了单细胞多肽样本，通过比较不同组细胞间的蛋白质组定量差异来识别各细胞周期的蛋白标记物，并研究标记物间的相关性（图7）。通过研究蛋白质与细胞周期的协变作用（covariation），Nikolai Slavov团队发现泛素化蛋白在G2阶段大量增加。协变也可能是产生不同细胞类型的原因。他们将同样的分析思路用于研究耐药性和非耐药性黑色素瘤单细胞的蛋白组差异，发现两种细胞间的差异蛋白与先前文献报导的细胞耐药性标记物相关，且表达耐药性标记物的黑色素瘤细胞主要聚集在细胞周期G1期（图8）。
图7. 单细胞蛋白质组学在研究细胞周期中的应用
图8. 单细胞蛋白质组学在研究蛋白质与细胞周期协变中的应用
5. plexDIA
前述的pSCoPE技术虽然能够提高样本分析通量和多肽鉴定率，但这种方式仍仅能分析样本中的一部分肽段。而使用数据非依赖性采集（Data Independent Acquisition, DIA）模式进行分析时，我们则能够较稳定地获取整个样本的肽段信息。目前还没有在DIA模式下有效使用多重通路分析的研究，多重通路技术如TMT等，可以让我们同时平行分析多个样本，而DIA则扩大了数据的采集范围。因此，Nikolai Slavov团队开发了一种基于多重通路（Mutiplex）的DIA数据采集和分析方法，即plexDIA (Derks et al., 2021)。在不减少数据覆盖深度和定量精确度的同时，实现多重样本的独立分析。该研究采用比例已知的1）U-973细胞系或Jurkat细胞系、2）大肠杆菌E.coli、和3）酵母菌S. cerevisiae的三种混合物分别进行无标记（Label free，LF）DIA分析和经同位素标记后的plexDIA分析。结果显示，在1小时的分析中，plexDIA采集到的肽段数目是LF-DIA单次运行的三倍；且plexDIA的多次运行间具有更好的重现性，超过6000种蛋白在三次技术重复中都被鉴定到。此外，plexDIA采集到的数据更完整、仅有2%的缺失值。他们将plexDIA用于平行分析多种单细胞的蛋白质组，在Thermo Q-Exactive质谱仪中，仅15分钟的有效梯度就从单个细胞中定量了约1000种蛋白质。
图9. plexDIA可以同时提高样本的分析通量、数据覆盖深度和重复性
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本次线上会议Nikolai Slavov教授为我们分享了很多单细胞蛋白质组学领域的前沿技术，令人为之振奋！这些构思精湛的新技术大幅推动了蛋白质组学的进步，让我们有机会从蛋白组的层面上窥见每个细胞的秘密。相信随着单细胞蛋白质组学技术的发展，越来越多与细胞异质性相关的生物学问题会得到阐释。我们也期待国内能涌现出像Nikolai Slavov一样的有为科学家，为我们带来更惊喜的技术创新。
参考文献
Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., & Slavov, N. (2018). SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biol, 19(1), 161. doi:10.1186/s13059-018-1547-5
Derks, J., Leduc, A., Huffman, R. G., Specht, H., Ralser, M., Demichev, V., & Slavov, N. (2021). Increasing the throughput of sensitive proteomics by plexDIA. bioRxiv, 2021.2011.2003.467007. doi:10.1101/2021.11.03.467007
Huffman, R. G., Leduc, A., Wichmann, C., di Gioia, M., Borriello, F., Specht, H., . . . Slavov, N. (2022). Prioritized single-cell proteomics reveals molecular and functional polarization across primary macrophages. bioRxiv, 2022.2003.2016.484655. doi:10.1101/2022.03.16.484655
Leduc, A., Huffman, R. G., Cantlon, J., Khan, S., & Slavov, N. (2022). Exploring functional protein covariation across single cells using nPOP. bioRxiv, 2021.2004.2024.441211. doi:10.1101/2021.04.24.441211
Slavov, N. (2022). Learning from natural variation across the proteomes of single cells. PLoS Biol, 20(1), e3001512. doi:10.1371/journal.pbio.3001512
Specht, H., & Slavov, N. (2021). Optimizing Accuracy and Depth of Protein Quantification in Experiments Using Isobaric Carriers. J Proteome Res, 20(1), 880-887. doi:10.1021/acs.jproteome.0c00675
